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人多能性干細(xì)胞ESCs/iPSCs在誘導(dǎo)腦類器官的應(yīng)用
發(fā)布日期：
2020-07-16
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過(guò)去，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）藥物研究主要依賴于嚙齒動(dòng)物模型或細(xì)胞體外模型等傳統(tǒng)方法。由于人類和嚙齒類動(dòng)物間的物種差異，所獲得的數(shù)據(jù)難以真實(shí)地模擬神經(jīng)發(fā)育和疾病機(jī)制等。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，培養(yǎng)人大腦類器官成為目前神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域炙手可熱的研究項(xiàng)目。大腦類器官是模擬人腦的生理特性的*的工具，可用于研究正常腦與疾病腦的建模，用于闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，亦可用于神經(jīng)發(fā)育疾病的探索，或用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物篩選的工具。
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| 01 |腦類器官培養(yǎng)方法概述 |
腦類器官通常從人多能性干細(xì)胞(ESCs/iPSCs)開(kāi)始培養(yǎng)，自發(fā)形成腦發(fā)育早期所具備的結(jié)構(gòu)和層次。但腦細(xì)胞團(tuán)簇達(dá)到一定尺寸后，可發(fā)育的階段會(huì)受到營(yíng)養(yǎng)缺乏和氧供應(yīng)的限制，繼而神經(jīng)元開(kāi)始死亡，結(jié)構(gòu)停止發(fā)育。 目前，大腦類器官的培養(yǎng)主要分為兩種方法，引導(dǎo)分化法 (Guided)和非引導(dǎo) (Un-guided)分化法。 ①非引導(dǎo)分化法依賴于細(xì)胞自身的形態(tài)發(fā)生和內(nèi)在的分化能力，將外在干擾小化，得到的類器官有前腦、中腦、后腦、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)叢等多種細(xì)胞譜系，該種方法的缺陷在于高可變性和異質(zhì)性。 ②而引導(dǎo)分化法是加入一些外源性的模式因子，誘導(dǎo)hPSCs分化為想要的細(xì)胞譜系。 在類器官結(jié)構(gòu)中，多能性干細(xì)胞(ESCs/iPSCs)誘導(dǎo)為擬胚體 (Embryoid Body, EB)，在外胚層形成后，引導(dǎo)分化為神經(jīng)或非神經(jīng)方向。引導(dǎo)分化法獲得的類器官依賴分化過(guò)程中添加的生長(zhǎng)因子，大多數(shù)是腦區(qū)特異性的，如皮層、海馬、中腦、大腦等。引導(dǎo)分化法得到的類器官含有神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及其他的大腦細(xì)胞。由于是引導(dǎo)性分化，批次間的可變因素少，可以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)比例的特異性細(xì)胞類型。很多團(tuán)隊(duì)都在嘗試用不同的方法來(lái)培養(yǎng)類器官，分別培養(yǎng)腦區(qū)特異的類器官后再將其共培養(yǎng)，類器官會(huì)自我融合形成含有不同腦區(qū)的類器官，該模型可以用于研究腦區(qū)間的相互作用。 |
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| 02 |3D大腦類器官的制作方法 |
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2013年，Lacaster和Knoblich等發(fā)表在Nature及Nature protocol上的3D大腦類器官的制作方法使得體外用人多能干細(xì)胞 (包括胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)誘導(dǎo)3D大腦類器官的技術(shù)前進(jìn)了一大步，他們通過(guò)使用一種允許類器官獲取能量和氧氣的新方法克服了這一局限，使用一個(gè)微小的振動(dòng)刀片將類器官切成半毫米切片，然后將它們放在覆蓋富含營(yíng)養(yǎng)的液體的多孔膜上。然后，類器官可同時(shí)從上方吸收氧氣，從下方吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其在培養(yǎng)物中繼續(xù)發(fā)育一年。圖1是該方法的概括。
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| 03 |文獻(xiàn)分享 |
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以下介紹了2014年，Lancaster發(fā)表在Nature Protocol上的“Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells”一文中從人多能性干細(xì)胞(iPSCs/ESCs)誘導(dǎo)腦類器官的方法：
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誘導(dǎo)EB形成 1-2h | 1. 當(dāng)ESCs/iPSCs在六孔板中長(zhǎng)到融合度為70-80%時(shí)用于誘導(dǎo)EB，通常每個(gè)六孔板孔的細(xì)胞可用于誘導(dǎo)一整個(gè)96孔板。
注：干細(xì)胞克隆的形態(tài)對(duì)于大腦組織形成的成功與否非常關(guān)鍵。克隆需呈現(xiàn)多能性的特征 (如邊緣清晰，克隆緊密等)，且無(wú)分化傾向；
對(duì)于無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ESCs/iPSCs：
① 用1ml的無(wú)鈣鎂的D-PBS洗滌細(xì)胞后，向每孔中加入600μl的含0.5mM的EDTA的無(wú)鈣鎂的D-PBS溶液。培養(yǎng)箱孵育4min；
② 輕柔吸出EDTA溶液，注意不要破壞克隆，加入1ml的Accutase。放回培養(yǎng)箱孵育4min；
③ 用1ml的mTeSR1培養(yǎng)基吹散克隆，使其從培養(yǎng)皿底部脫落。轉(zhuǎn)移2ml至15ml離心管中，用1ml移液器將克隆吹散為渾濁的單細(xì)胞懸液；
④ 270g 室溫離心細(xì)胞5min，同時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)死細(xì)胞，用血細(xì)胞儀或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀細(xì)胞計(jì)數(shù)；檢測(cè)兩次取平均值；
⑤ 用1ml的含50μM的ROCK抑制劑Y-27632的低bFGF的ESCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打，保證細(xì)胞呈單細(xì)胞重懸的狀態(tài)。然后，用含Y-7632的低FGF-2的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為每150μl含9000個(gè)活細(xì)胞；
⑥ 每個(gè)96孔板孔中放入150μl的細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； | 飼養(yǎng)EB,早期胚層分化 5-7d | 2. 24h后，顯微鏡下觀察,可見(jiàn)有清晰邊緣的小的EB形成,邊緣有許多死細(xì)胞圍繞在EB周?chē)?為正?，F(xiàn)象，不會(huì)干擾EB在中間形成,繼續(xù)置于37℃的5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3. 隔天輕柔地吸去半量培養(yǎng)基,避免干擾到EB和底部的細(xì)胞,補(bǔ)充150μl的新鮮培養(yǎng)基(總體積會(huì)大于150μl,量的準(zhǔn)確與否不重),培養(yǎng)基中添加Y-27632(1:100),FGF-2濃度為4ng/ml,直到EB直徑大于350-450μm為止,通常,僅前4天需要添加二者；
4. EB直徑達(dá)到350-600μm時(shí)，用3中的培養(yǎng)基隔天飼養(yǎng)EB,培養(yǎng)基中不含Y-27632和FGF-2； | 原始神經(jīng)上皮的誘導(dǎo) 4-5d | 5. EB直徑達(dá)到500-600μm時(shí)，邊緣開(kāi)始變得明亮，并且呈現(xiàn)光滑的邊緣 (通常為第6天)，將每個(gè)EB用剪掉槍頭的200μl移液器轉(zhuǎn)移至含有500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的低吸附24孔板中，輕柔且不要破壞EB，繼續(xù)培養(yǎng)； 注：將200μl移液器槍頭剪掉，使開(kāi)口直徑約為1-1.5mm。確保開(kāi)口不要太小，避免破壞EB，但也不能太大，太大會(huì)難以吸去EB。不要試圖用刮刀將EB鏟出，會(huì)破壞EB的結(jié)構(gòu)；
6. 轉(zhuǎn)移至24孔板后，另外加入500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基飼養(yǎng)EB；
7. 2d后，組織培養(yǎng)顯微鏡觀察EBs，形態(tài)邊緣變得更加明亮，提示神經(jīng)外胚層的分化；一旦這些區(qū)域開(kāi)始顯示與神經(jīng)上皮形成一致的假?gòu)?fù)層上皮的放射狀組織，這一般發(fā)生在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的4-5d后，繼續(xù)進(jìn)行第8步，將組織聚集轉(zhuǎn)移到Matrigel液滴中；
注：健康的細(xì)胞聚集有光滑的邊緣，神經(jīng)上皮邊緣在光學(xué)上呈半透明狀。有時(shí)組織可能在光學(xué)上表現(xiàn)為非放射狀組織的半透明組織，雖然這不是理想狀態(tài)，但沒(méi)有觀察到這對(duì)類器官形成有長(zhǎng)期的負(fù)面影響。重要的是，如果在神經(jīng)誘導(dǎo)中再多放置1-2天，這些非放射區(qū)域就會(huì)變成放射狀，但是如果不及時(shí)轉(zhuǎn)移到基質(zhì)凝膠(步驟8)，其他已經(jīng)放射狀的區(qū)域可能開(kāi)始收縮并失去形成神經(jīng)上皮芽的能力。當(dāng)有神經(jīng)外胚層出現(xiàn)時(shí)，需盡快將組織轉(zhuǎn)移到Matrigel中，如果太晚，會(huì)影響腦組織的晚期形態(tài)； | 將神經(jīng)外胚層組織轉(zhuǎn)移至Matrigel液滴中 1-2h | 8. 4℃下冰上解凍Matrigel。觀察發(fā)現(xiàn)，500μl的Matrigel在冰水混合物浴時(shí)，1-2h后會(huì)恢復(fù)液體狀態(tài)； 9. 將Parafilm膜置于一個(gè)空的帶有凹坑的中號(hào)槍頭盒上，將手指按向Parafilm膜形成凹坑，每個(gè)坑的體積約為200μl；
注：Parafilm不能高壓滅菌，所以不能*滅菌，因此需保證Parafilm膜保存在干凈的環(huán)境中，準(zhǔn)備凹坑前，向手套和Parafilm膜噴灑70%乙醇消毒；在這一步也可以在培養(yǎng)基中添加抗生素以避免污染；
10. 將Parafilm膜用剪刀修剪為單個(gè)含4x4(共16個(gè))凹坑大小的正方形，將其放入60mm的組織培養(yǎng)皿中；
11. 用200μl的移液器轉(zhuǎn)移神經(jīng)外胚層組織，每個(gè)凹坑中放置1個(gè)；
注：將200μl移液器槍頭剪掉，使開(kāi)口直徑約為1.5-2mm。確保開(kāi)口不要太小，避免破壞EB，但也不能太大，太大會(huì)難以吸去EB。不要試圖用刮刀將EB鏟出，會(huì)破壞EB的結(jié)構(gòu)；
12. 用未剪頭部的200μl移液器小心地吸去組織邊緣多余的培養(yǎng)基；
13. 每個(gè)組織快速滴入Matrigel，每孔約30μl，使Matrigel滴入Parafilm凹坑中；
注：快速滴入Matrigel，避免組織干掉。盡量一次性滴入Matrigel，一次性包埋好16個(gè)組織；
14. 用10μl的移液槍頭移動(dòng)組織，使組織位于液滴的中央，這一步需要在滴入Matrigel后立即進(jìn)行，因?yàn)槭覝叵翸atrigel非常容易固化；
15. 將此60mm培養(yǎng)皿置入37℃培養(yǎng)箱中，孵育20-30min以使Matrigel聚合；
16. 取出60mm培養(yǎng)皿，加入5ml不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基；
17.將Parafilm膜反過(guò)來(lái)并搖動(dòng)培養(yǎng)皿，直至Matrigel液滴從凹坑中滴入培養(yǎng)基中；不容易脫落的液滴可以用鑷子用力晃動(dòng)Parafilm膜使其脫落，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)組織。 | 神經(jīng)上皮芽的固定培養(yǎng) 4d | 18. 24h后，觀察包埋的組織，1-3d內(nèi)，組織會(huì)呈現(xiàn)包含液體空腔的進(jìn)一步擴(kuò)張的神經(jīng)上皮樣； 注：從Matrigel主體中會(huì)遷移出一些細(xì)胞類型，通常呈成纖維細(xì)胞樣，這些細(xì)胞代表了非神經(jīng)特性的群體，從神經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)逃脫出來(lái)；然而這些細(xì)胞通常不能生存，且遷移出來(lái)后，對(duì)神經(jīng)上皮芽的形成呈現(xiàn)促進(jìn)作用；
19. 將液滴繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將培養(yǎng)基更換為不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h；
注：換液時(shí)，傾斜培養(yǎng)皿使液滴下沉，輕柔吸出培養(yǎng)液。盡量在不破壞類器官的情況下，吸出更多的培養(yǎng)液。更換為5ml的新鮮培養(yǎng)液； | 腦組織的生長(zhǎng) ~1年 | 20. 4h的靜止培養(yǎng)后，用開(kāi)口約為3mm的剪去頭部的1ml移液槍頭將包埋好的類器官轉(zhuǎn)移至125ml的震動(dòng)反應(yīng)器中，加入75~100ml的含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)液，將此生物反應(yīng)器放置在培養(yǎng)箱中安裝的磁攪拌板或軌道振動(dòng)篩上用85rpm的速度震動(dòng)。也可以將60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液更換為含Vitamin A的腦類器官培養(yǎng)液，將其置于軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)； 注：每個(gè)生物反應(yīng)器中不要轉(zhuǎn)移超過(guò)2個(gè)60mm培養(yǎng)皿的類器官(32個(gè))，太多類器官會(huì)引起類器官的融合；
使用低速攪拌攪拌板，因?yàn)槌Ｒ?guī)速度的攪拌棒會(huì)因磁力攪拌而引起發(fā)熱；
軌道振動(dòng)篩可用于分析多種培養(yǎng)條件，同時(shí)使用多種基因突變劑處理，而傳統(tǒng)的攪拌板只能同時(shí)防止4-6個(gè)單獨(dú)的瓶；用生物反應(yīng)器和軌道振動(dòng)篩培養(yǎng)的腦類器官未觀測(cè)到有區(qū)別；
21. 振動(dòng)篩上的類器官每3-4天全量換液，搖瓶上的類器官每周換液，注意觀察形態(tài)；在合適的時(shí)間點(diǎn)取樣本用于實(shí)驗(yàn)研究； |
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PeproTech提供人腦類器官培養(yǎng)所需的各種細(xì)胞因子及小分子，并提供人ESC/iPSCs培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基及培養(yǎng)器皿包被基質(zhì)，產(chǎn)品詳情如下表：
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| 04 |參考文獻(xiàn) |
1.Chhibber T et al.(2020). CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today Feb;25(2):456-465. 2.Lancaster, M.A. et al. (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379 3.Lancaster, M.A. and Knoblich, J.A. (2014) Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 9, 2329-2340. |
